Весной 1509 г. французы двинулись на Тревильо в долине Адды, что и положило начало войне, которую Паоло Джовио, историк и современник событий, назвал «самой продолжительной и самой ужасной из всех, какие велись со времени изгнания готов». Почти месяц ушел на мелкие стычки и сложное маневрирование обеих армий. Франция, отобрав за 11 дней все ломбардские владения Венеции, не склонна была далее продолжать активную борьбу. Только 14 мая главные силы Венеции и Лиги встретились у Анья-делло. Венецианские войска оказали упорное сопротивление численно превосходящему противнику. Мощным ударом с фланга тяжеловооруженной французской коннице удалось смять и обратить в бегство легкую венецианскую кавалерию, но пехота, состоявшая в основном из ополченцев, осталась на месге, выдерживая натиск гасконских стрелков, швейцарских копейщиков и французской и итальянской кавалерии. Она была перебита лишь при помощи артиллерии.
Венеция, безусловно, могла гордиться мужеством и стойкостью своих граждан. Несмотря на поражение, сражение при Аньяделло остается наиболее героической страницей в истории Венецианской республики.
В результате огромных людских потерь Светлейшая оказалась в трагическом положении, а между тем ей предстояло защищать огромную, по итальянским масштабам, территорию. Она могла рассчитывать лишь на верность и силу сопротивления своих подданных.
Венецианский Сенат, по сообщению М. Санудо, пошел на такую меру, как освобождение всех городов республики от клятвы верности Венеции, чтобы спасти их от разрушения, а жителей от резни, ибо «само имя „венецианец" было ненавистно ее врагам». Одновременно Венеция обещала награду каждому городу, который сможет создать у себя ополчение и гарнизон. В остальном города республики были предоставлены сами себе. Оставшиеся у Венеции отряды предназначались для защиты столицы.
В июне 1509 г. войска императора заняли Верону, Виченцу и Падую. Герцог Феррарский захватил для папы Эсте, Полезино и Монселиче. Французы закрепились в ломбардской части, между Адидже и По, оставив швейцарцам долину Бренты и Пьяве. Враг подступал к самой Венеции.