В пору своего пребывания на архипелаге орден Святого Иоанна Иерусалимского превратился в мощную державу, обладающую лучшим в Европе флотом. Почти 200 лет его корабли контролировали морскую часть Средиземноморья, обеспечив союзу славу «морского щита» Европы. Огромные конвойные суда с белым восьмиконечным крестом защищали торговые суда от турецких корсаров. Трижды в год галеры ордена выходили на корсо – так называлась погоня за пиратскими судами в открытом море. Члены экипажей захваченных кораблей становились рабами, поэтому в орденском флоте не ощущалось недостатка галерных гребцов. Кавалеры участвовали в морских сражениях, считая долгом оказывать помощь правителям Испании, Рима, Венеции, Генуи, Неаполя и Пармы. Один из главных маршрутов патрулирования мальтийских галер начинался в Неаполе, проходил через Мессину и завершался в Валлетте, обеспечивая снабжение острова, а также постоянную связь с материковыми государствами.
В 1571 году команда доблестного капитана Пьетро Джустиниани помогла итальянцам разгромить турок в морском сражении при Лепанто: 3 мальтийские галеры вступили в бой с 30 кораблями противника, потопив всю флотилию ценой единственного судна. После того боя Турция надолго утратила господство на просторах Средиземного моря. Для Османской империи это поражение стало первым проявлением слабости. Тем не менее опасность вторжения турок была реальной, особенно когда султан Селим, сын Сулеймана и его любимой жены, бывшей наложницы-украинки Роксоланы, захватил Тунис, в последний момент обойдя Мальту стороной.
Участием Мальтийского ордена отмечены военные экспедиции испанцев в Алжире и французов в Канаде. Заметный след в истории войн оставил поход, завершившийся взятием городов Наварин и Хиос. В начале XVII века мальтийские кавалеры высадились на западном побережье Пелопоннеса, опустошив города Лепанто и Патры. Им принадлежит сомнительная заслуга в захвате Коринфа, победе при Сан-Маро, усмирение бунтовщиков в герцогствах Парма и Пьяченца.