В 1534 г. из Санлукара отплыла экспедиция дона Педро де Мендосы, состоявшая из 14 кораблей. Посетив Рио де Жанейро (где в свое время Вес-пуччи основал форт), экспедиция прибыла в бухту Ла Платы и здесь заложила город Санта Мария дельБуэн Айре, или Буэнос-Айрес. Название это происходит от имени девы Марии, покровительницы цеха моряков в Севилье.
Вскоре экспедиции пришлось столкнуться с племенем керанди, причем беспокойство, причиняемое туземцами, было настолько велико, что Мендоса решил двинуться дальше вверх по реке (правда, оставив гарнизон из 400 человек и 4 корабля). По прибытии в Санкти Спириту испанцы занялись перестройкой этого фэрта. Оставив в качестве начальника колонии Хуана де Айолас, Мендоса в 1536 г. возвратился в Испанию. Айолас предпринял экспедицию вверх по реке Парагвай. По пути им был заложен город Асунсьон, который быстро разросся благодаря благоразумной политике Айоласа по отношению к местному населению. Кроме того, им была основана колония в Канделарии. Начальником ее был назначен Мартинес Ирала, который, однако, не смог там удержаться и вернулся в Асунсьон. Сам Айолас был убит туземцами при исследовании Гран Чако. В 1538 г. в Асунсьоне были сосредоточены гарнизоны Санкти Спириту и Буэнос-Айреса. Благодаря организаторским талантам Иралы город быстро превратился в процветающую колонию.
В 1541 г. к берегам Бразилии прибыла новая экспедиция во главе с Нуньесом Кавеса де Вака. Здесь экспедиция разделилась: часть ее поднялась на судах по реке Ла Плате, а другая, пройдя через центральную часть Бразилии, добралась до Асунсьона. Нуньес, так же как и Айолас, стремился достичь Перу по суше и с этой целью предпринял ряд экспедиций, которые все, однако, окончились безрезультатно. Экспедиция Нуньеса окончилась тем, что сам он был смещен восставшими колонистами и доставлен в Испанию в качестве арестанта.
Ирала настойчиво продолжал стремиться к реализации этого плана, и, наконец, новая его экспедиция увенчалась успехом.