Помимо создания шедевров живописи и конной статуи для Франческо Сфорца (см. ниже), он как ведущий инженер занимался проектированием системы каналов. Кроме того, он был придворным портретистом и организатором пышных и оригинальных праздников для Людовико, вследствие чего Милан не только достиг политического и экономического расцвета, но и превратился в один из самых блистательных городов континента, в средоточие культуры.
Этот первый миланский период его жизни внезапно закончился в 1499 году, когда его покровитель Людовико Сфорца был свергнут французскими войсками. Через Мантую и Венецию Леонардо снова направился во Флоренцию, где написал свою всемирно известную «Мону Лизу».
В мае 1506 года Леонардо снова вернулся в Милан по приглашению французского наместника Шарля д’Амбуаза и оставался там до 1516 года, уезжая лишь на короткое время во Флоренцию для урегулирования споров о наследстве. В этот второй миланский период он проявил себя не столько как живописец, сколько как превосходный рисовальщик анатомических эскизов, которые были основаны, прежде всего, на изучении человеческого тела при вскрытии. Особый интерес он проявлял к сложному двигательному аппарату с мышцами и сухожилиями, а также к изучению внутренних органов человеческого организма, о чём свидетельствуют изображения матки с плодом. Эти детальнейшие рисунки опередили современную ему медицину не только на десятилетия, но даже на века, и потому у практикующих врачей они почти не нашли применения.
Одновременно Леонардо вновь занялся работой над конной статуей – на сей раз для французского кондотьера Джана Джакомо Тривульцио. Но она, как и статуя для Франческо Сфорца, так и не была отлита.
После того, как в 1511 году внезапно умер его меценат Шарль д’Амбуаз, а в 1512 году из Милана были изгнаны французы, знаменитый художник отправился на несколько лет в Рим. Зимой 1516–1517 гг. он принял приглашение французского короля Франциска I и переехал во Францию. Здесь 23 апреля 1519 года в городе Клу, недалеко от резиденции Амбуазов, гений-универсал умер.