В завещании она назначила наследницей свою дочь Хуану (Хуана и Екатерина были единственными оставшимися в живых отпрысками «католических королей»), отметив, что, в случае если она окажется неспособной принять бразды правления, регентом должен будет стать Фердинанд, до того времени как первенцу Хуаны исполнится двадцать лет. Личная уния Арагона и Кастилии сохранилась; но честолюбие Филиппа Красивого вскоре нарушило все расчеты Фердинанда и Изабеллы. Филипп пожелал управлять Кастилией.
Еще в сентябре 1504 г. он заключил союз с Людовиком XII, по которому было подтверждено прежнее соглашение о браке принцессы Клавдии с принцем Карлом, которому передавалось неаполитанское королевство. В то же время Филипп пытался привлечь на свою сторону Гонсало де Кордову и других испанских военачальников. Поэтому Фердинанд не решился открыто воспротивиться притязаниям своего зятя и на время отстранил его от регентства в Кастилии. Но он тотчас же совершил ловкий дипломатический ход и подписал с Людовиком XII (12 октября 1505 г.) договор, по которому все права на неаполитанское королевство французский король передавал своей племяннице Жермене де Фуа. Фердинанд должен был вступить с ней в брак, а Людовик XII обязался не претендовать на неаполитанскую корону, которую должны были унаследовать дети Фердинанда, и Жермены. Известие об этом договоре побудило Филиппа предпринять шаги к примирению с тестем, и он решил договориться с ним о разделе регентских прав на Кастилию. Но планы эти не удалось осуществить и не только потому, что они были несовместимы с честолюбивыми стремлениями эрцгерцога; проект Филиппа встретил сопротивление со стороны кастильской знати, враждебной Фердинанду. В результате было заключено компромиссное соглашение, по которому за Филиппом осталось регентство, а Фердинанд сохранял пост магистра духовно-рыцарских орденов Кастилии и право на получение половины доходов с Гранадского королевства. Обманутый в своих надеждах, Фердинанд удалился в «арагонские владения, причем, как сообщает один историк XVI в., он совершил по пути в некоторых городах поступки весьма недостойные и подлые, а посему другие города закрыли перед ним ворота и не пожелали его принять».