Второй период кампании был очень неудачен для Карла. Франциск собрал армию и вторгся в Италию (октябрь 1524 г.), овладел Миланом и осадил Павию, в которой укрылся командующий войсками Карла Антонио де Лейва, Для императора сложилась тяжелая обстановка. Недавние союзники—Венеция и папа (Адриан умер Нсентября 1523 г., и папой был избран Климент)—откололись от него; в Германии назревало восстание; и Карл не мог положиться ни на Англию, ни на своего собственного брата Фердинанда, претендовавшего на герцогство Миланское.
Третий, заключительный, период кампании принес быстрые и неожиданные изменения. Соединенные войска герцога Бурбонскою и маркиза де Пес кары общей численностью в 20 ООО человек, состоявшие преимущественно из немецких наемников и испанских аркебузиров, появились перед Павией, где 24 февраля 1525 г. произошла решающая битва, в результате которой французы были полностью разгромлены и сам французский король попал в плен. Он был отвезен в Испанию и заключен со всеми полагающимися почестями в замок Луханес, в Мадриде, где перенес очень тяжелую болезнь.
13 января 1526 г. был подписан мирный договор, по которому Франциск уступил Карлу Бургундию в ее старых границах и отказывался от всех своих прав на Италию и Нидерланды. Кроме того, он обязывался вернуть герцогу Бурбонскому все его земли и титулы и предоставить в распоряжение испанского короля французскую армию. Но этот договор оказался бесплодным. Франциск не намеревался выполнять его. Он нарушил его тотчас же, как получил свободу. Дела снова принимали дурной оборот для Карла, так как еще несколько раньше (30 августа 1525 г.) Англия порвала союз с Испанией и заключила с Франциском мир, а в Италии папа и другие властители стремились избавиться от императорского владычества. Драматическим поводом к разрыву отношений с Англией послужило бесчеловечное обращение Генриха VIII со своей супругой, королевой Екатериной, дочерью католических королей. Возможно, что одной из причин жестокого обращения с женой было желание Генриха VIII дать повод к разрыву с Карлом.